Analisi molecolare per l’endo-poligalatturonasi in Pyrenophora graminea

Pyrenophora graminea Ito e Kuribayashi è un fungo ascomicete agente della striatura bruna dell’orzo e tipicamente trasmesso per seme. Le conoscenze sui meccanismi patogenetici di P.graminea sono relative esclusivamente alla produzione di composti fitotossici coinvolti nello sviluppo e nella intensità dei sintomi; sono noti, infatti, uno o più composti capaci di indurre sintomi tipici quando infiltrati in foglie di orzo (Haegi et al., 1994). Nell’ambito di una ricerca il cui intento è quello di fornire informazioni sulle basi genetico-molecolari della patogenicità, è stata intrapresa un’indagine sulla presenza ed espressione di geni per l’endo-poligalatturonasi in P.graminea. L’endo-poligalatturonasi (endo-PG) prodotta dai funghi svolge un ruolo importante nella degradazione delle pareti cellulari delle piante, digerendo i componenti pectici della lamella mediana e della parete primaria. La produzione di poligalatturonasi è generalmente sottoposta ad induzione da parte del substrato e a repressione da parte di fonti di carbonio preferenziali, quali ad esempio il glucosio. In alcuni casi però, come in Cochliobolus heterostrophus e in Aspergillus flavus, la sintesi di endo-PG non è repressa dal glucosio (Bateman et al., 1973; Whitehead, 1995). Questo enzima è spesso prodotto in forme molecolari multiple, sia in coltura che durante l’infezione della pianta, con differenti proprietà biochimiche e fisiologiche (Favaron e Marciano, 1992). In prove preliminari, condotte con saggi enzimatici in piastra, era stata verificata la presenza di attività poligalatturonasica in diversi ceppi di P.graminea; per appurare un eventuale coinvolgimento delle poligalatturonasi nella patogenicità di questo fungo, si è deciso, quindi, di condurre un analisi molecolare di espressione utilizzando, come sonde, geni eterologhi dell’endo-PG clonati (Scott-Craig et al., 1990; Caprari et al., 1993). Come confronto è stato analizzato in alcuni esperimenti anche un ceppo di P.teres. Le sonde pCC2 e pCC33, relative al gene dell’endo-PG rispettivamente di Fusarium moniliforme e di Cochliobolus carbonum, sono state inizialmente utilizzate sul DNA genomico di un ceppo di P.graminea (Pg2) e di uno di P.teres (Pt4); il risultato degli esperimenti di Southern blot ha dimostrato che le due sonde risconoscono una sequenza genomica in entrambe Pg2 e Pt4. Si è quindi proceduto all’analisi dell’espressione dell’endo-PG nei due ceppi, mantenuti in coltura liquida in condizioni induttive e non (pectina; pectina e saccarosio in diverse proporzioni; saccarosio). Gli esperimenti di Northern blot hanno evidenziato in ambedue i ceppi un segnale di espressione, non molto intenso data l’eterologia della sonda, senza differenze significative tra i mezzi utilizzati. Nel tentativo di isolare il gene omologo dell’endo-PG di P.graminea e di P.teres, sono stati effettuati esperimenti di PCR, utilizzando oligonucleotidi sintetizzati sulla base della sequenza genica clonata in F.moniliforme. Da entrambi i ceppi di Pyrenophora è stato ottenuto un prodotto di PCR con peso molecolare compatibile con quello atteso per il gene dell’endo-PG. I due frammenti (Pg2-PCR e Pt4-PCR) sono stati quindi riutilizzati come sonde omologhe in esperimenti di Southern blot e Northern blot. i) Le due sonde omologhe (Pg2-PCR e Pt4-PCR) utilizzate in esperimenti di Southern-blot, effettuati su i due DNA genomici (Pg2 e Pt4) tagliati con enzimi di restrizione diversi, hanno presentato profili di ibridazione simili. ii) Gli esperimenti di Northern-blot hanno evidenziato una espressione di endo-PG, apparentemente indipendente dai mezzi di coltura, il cui andamento è costante con entrambe le sonde. In conclusione i prodotti di PCR, ottenuti dai genomi dei due ceppi Pg2 e Pt4, rappresentano una parte del gene dell’endo-PG di Pyrenophora; essi costituiscono, così, uno strumento più sensibile per una analisi fine di espressione con sonde omologhe, ma soprattutto, consentiranno uno studio strutturale del gene dell’endo-PG in P.graminea e in P.teres. Al momento sono in corso esperimenti che estendono nel tempo l’analisi di espressione (campioni mantenuti in coltura su tre mezzi diversi: pectina 1% e saccarosio 0,2%; pectina 1% e saccarosio 1,2%; saccarosio 1,2%; tutti con 6 tempi d’induzione) ed in parallelo, sui filtrati colturali degli stessi campioni esaminati, vengono effettuati saggi di attività enzimatica. Le ricerche proseguiranno per accertare la reale importanza dell’endo-PG nell’interazione P.graminea/orzo, confrontando l’andamento dell’espressione osservato su mezzi di crescita contenenti pectina commerciale con quello ottenuto per colture cresciute su estratti di pianta e con quello osservabile direttamente nella pianta infetta.