Quantitative label-free infrared microscopy of lung tissues from rabbit models of bronchopulmonary dysplasia

Bronchopulmonary dysplasia (BPD) is a chronic lung disease affecting extremely preterm neonates, causing significant long-term respiratory consequences. While hyperoxia-exposed preterm rabbits have been proposed as BPD models in pharmacological studies, lung alterations are conventionally assessed using classical histology and immunolabelling. Although fundamental in preclinical research, these methods often require multiple stains and tissue sections to reveal key BPD features. Additionally, the limited availability of validated antibodies for rabbits demands time-consuming optimization. This study introduces a label-free, multi-modal imaging platform combining two-photon excitation fluorescence (TPEF), second harmonic generation (SHG), and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to characterize the lung parenchymal alterations induced by a 7-day hyperoxia exposure in preterm rabbits. Lung sections were obtained from preterm rabbit pups delivered at 28 days of gestational age (GA) (term 31 GA) either exposed for 7 days to normoxia (21% O2) or hyperoxia (95% O2), to mimic BPD. Lung sections were scanned with TPEF microscope at 780 nm and tissue intrinsic signals including autofluorescence intensity and lifetime, as well as SHG from collagen were simultaneously collected in the 470-570 nm, 420-460 nm, and 380-410 nm ranges, respectively. BPD-relevant features were extracted from images, validated through traditional staining and immunolabelling and analyzed using an optimized pipeline. The platform’s validity was confirmed by correlating label-free features with conventional H&E-derived histomorphological parameters and lung function measurements. This method simultaneously resolves key BPD-related features, such as tissue density, alveolar exudates, increased collagen deposition, arterial medial thickening, and alveolar simplification, effectively discriminating between hyperoxia and normoxia samples without dyes or antibodies. Quantitative outputs from the label-free pipeline strongly correlate with traditional histology and lung function measurements, confirming its robustness. This approach holds promise as a powerful tool for preclinical research, enabling simultaneous imaging and quantification of multiple pathological features with a single label-free acquisition. Ultimately, this platform can complementconventional histology and immunolabelling to provide a more comprehensive and detailed assessment of tissue alterations.

La displasia broncopolmonare (BPD) è una malattia polmonare cronica che colpisce i neonati molto prematuri. Sebbene i conigli pretermine esposti a iperossia siano stati introdotti come modelli di BPD, solitamente le alterazioni polmonari vengono valutate mediante analisi istologiche classiche e l’uso di anticorpi. Pur fondamentali nella ricerca preclinica, questi metodi richiedono molteplici colorazioni e sezioni tissutali per evidenziare le caratteristiche principali della BPD. Inoltre, la limitata disponibilità di anticorpi validati nel coniglio richiede una lunga ottimizzazione dei protocolli sperimentali. In questo studio presento una piattaforma di imaging multimodale e senza marcatori che combina microscopia a due fotoni, seconda generazione armonica e tempo di vita della fluorescenza, per caratterizzare le alterazioni del parenchima polmonare nei conigli pretermine dopo 7 giorni di esposizione all’iperossia. Le sezioni polmonari sono state ottenute da conigli fatti nascere prematuramente a 28 giorni di età gestazionale (termine: 31 giorni) ed esposti per 7 giorni a normossia (21% O₂) o iperossia (95% O₂). Le sezioni sono state eccitate a 2-fotoni a 780 nm, e l’intensità e il tempo di vita dell’autofluorescenza, nonché il segnale SHG del collagene, sono state raccolti rispettivamente nei range 470-570 nm, 420-460 nm e 380-410 nm. Le caratteristiche rilevanti per la BPD sono state estratte dalle immagini, validate mediante colorazioni tradizionali e anticorpi, e analizzate attraverso una pipeline ottimizzata. L'affidabilità del metodo è stata verificata correlando i parametri ottenuti in assenza di marcatori con quelli derivati dalla colorazione H&E e quelli di funzionalità polmonare. Questo metodo consente di rilevare simultaneamente elementi chiave della BPD, come densità tissutale, essudati alveolari, aumento della deposizione di collagene, ispessimento della tunica media arteriosa e semplificazione alveolare, distinguendo tra campioni iperossici e normossici senza l’uso di marcatori. I dati quantitativi mostrano una forte correlazione con l’istologia convenzionale e le misure di funzionalità polmonare, confermando la solidità del metodo. Questo approccio rappresenta uno strumento efficace per la ricerca preclinica, in grado di visualizzare e quantificare molteplici alterazioni patologiche con una singola acquisizione e può essere integrato alle metodologie istologiche tradizionali per una valutazione più completa delle alterazioni tissutali.